一、填空题
1. 限制性核酸内切酶和DNA连接酶是基因工程中两个重要的工具酶。
2. DNA复制的两大特点是半保留复制和半不连续复制
3. 细菌实施应急反应的信号是ppGpp和pppGpp产生这两种物质的诱导物是 空载tRNA启动子中的元件通常可以分为两种：核心启动子和上游启动子元件
4. 真核生物基因调控主要也是在转录水平上进行的，受大量特定的顺式作用元件和反式作用因子的调控，真核生物的转录调控大多数是通过两者复杂的相互作用来实现的。
5. 在大肠杆菌的转录过程中，RNA聚合酶全酶的σ因子负责转录的精确起始，核心酶负责转录的延伸
6. 真核生物mRNA转录后的加工步骤主要包括加帽、加尾、剪接、编辑
7. 与DNA结合的转录因子大多数以二聚体形式起作用，转录因子与DNA结合的功能域模体常见的有以下几种：螺旋-转角-螺旋、锌指结构、碱性-亮氨酸拉链、和碱性-螺旋-环-螺旋。
8. PCR的基本反应过程包括：高温变性、低温退火、中温延伸三个阶段。
10. 原核生物中DNA复制的主要酶是DNA聚合酶III，在真核生物细胞中核DNA复制的主要酶是DNA聚合酶δ。
11. 基因表达是受调控的，可在多个层次上进行，包括基因水平、转录水平、翻译水平、翻译后水平的调控
12. 蛋白质的生物合成是以mRNA为模板，以氨酰-tRNA为原料直接供体，以核糖体为合成场所。
二、选择题
1)亚硝酸作为一种有效诱变剂，是因为它直接作用于DNA，使碱基中的氨基氧化生成羰 (酮)基，造成碱基配对错误。（对）
2) 真核生物的各种RNA都必须经过剪切、修饰才能成熟。（对）
3) 大肠杆菌的mRNA在翻译蛋白质之前不需要加工。（对）
4) RNA的生物合成不需要引物。（对）
5) 如果没有σ因子，核心酶只能转录出随机起始的、不均一的、无意义的RNA产物。（对）
6) AC-Ds是玉米中的一组转座控制元件，其中Ds 来源于Ac 序列，AC对Ds的作用是顺式的。（对）
7) DNA的复制需要DNA聚合酶和RNA聚合酶。（对）
8) DNA复制时，滞后链的合成需要多个引物。（对）
四、名词解释
CpG岛、Prinbnow区、RNA的编辑、SD序列、操纵子、错义突变、代谢物阻遏效应、冈崎片段、核酶、基因家族、酵母人工染色体
真核基因表达的转录水平调控 真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在如下差异： 1，真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，原核生物中常见的多基因操纵子形式在真核细胞中比较少见。 2，真核细胞的DNA组蛋白和大量非组蛋白结合，只有一小部分DNA是裸露的。 3，高等真核细胞DNA中大部分不转录，真核细胞中有一部分由几个或几十个碱基组成的DNA序列，在整个基因组中重复几百次甚至上百万次。此外，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。 4，真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数，这种能力在原核生物中极为罕见。 5，原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于转录起始位点上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶对它的结合。真核生物中，基因转录的调节区则大得多，它们可能远离核心启动子几百个甚至上千个碱基对。虽然这些调节区也能与蛋白质结合，但是并不直接影响启动子区对与RNA聚合酶的接受程度，而是通过改变整个所控制基因5'上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。 6，真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转座穿过核膜，到达细胞质基质后，才能被翻译成蛋白质。原核生物中不存在这样严格的空间间隔。 7，许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能被顺利地翻译成蛋白质。 基因转录调节的基本要素包括顺式作用元件(coding region)，反式作用因子(trans-acting factor)和RNA聚合酶(RNA polymerase)。 顺式作用元件是指启动子和基因的调节序列。主要包括启动子，增强子(enhancer)，沉默子(silencer)等。反式作用因子是指能够结合在顺式作用元件上调控基因表达的蛋白质或者RNA。原核生物只有一种RNA聚合酶，真核生物有3种RNA聚合酶，催化转录不同的RNA产物。由于真核生物3种RNA聚合酶中，只有RNA聚合酶Ⅱ能够转录信使RNA前体，并在加工成熟后按照三联子密码的原理翻译成蛋白质产物，我们这里主要讨论RNA聚合酶Ⅱ的基因转录及其调控过程。 真核基因启动子由核心启动子和上游启动子两部分组成，是在基因转录起始位点(+1)及其5'上游100~200bp以内的一组具有独立功能的DNA序列，每个元件长度为7~20bp，是决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始位点和转录频率的关键元件。 1，核心启动子(core promoter)是指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游-25~-30bp处的TATA区。核心启动子单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录。 2，上游启动子元件(upstream promoter element , UPE) 包括通常位于-70 bp附近的CAAT区(CCAAT)和GC区(GGGCGG)等，能通过TF Ⅱ D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。 包括从转录起始位点到RNA聚合酶Ⅱ转录终止处的全部DNA序列。 RNA聚合酶Ⅱ是一类能够直接或间接与启动子核心序列TATA区特异结合，并启动转录的调节蛋白。RNA聚合酶Ⅱ在转录因子帮助下形成转录起始复合物。RNA聚合酶Ⅱ由至少10~12个亚基组成，各亚基的相对分子质量在1X10^4~2.4X10^5，有些亚基也在聚合酶Ⅰ，Ⅲ中共用。 4，RNA聚合酶Ⅱ基础转录所需的蛋白质因子(以"TF Ⅱ"表示)在生理条件下，RNA聚合酶Ⅱ基础转录所需的蛋白质因子形成转录起始复合物。TF Ⅱ D，TF Ⅱ B，和TF Ⅱ F与RNA聚合酶Ⅱ可在启动子上形成最初级复合物，开始转录mRNA，加入TF Ⅱ E和TF Ⅱ H后形成完整的转录复合物并转录出长链RNA，加入TF Ⅱ A可进一步提高转录效率。RNA聚合酶Ⅱ沿着模板滑动时TF Ⅱ D及TF Ⅱ A滞留在转录起始位点上，其他因子随聚合酶向模板DNA的3'端移动。关于RNA聚合酶Ⅱ如何整合成为转录起始复合物从而发挥作用，目前有两种假说，一种认为是一步结合，另一种认为是分步结合。 增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。 真核生物启动子和增强子是由若干DNA序列元件组成的，由于它们常与特定的功能基因连锁在一起，因此被称为顺式作用元件。这些序列组成基因转录的调控区，影响基因的表达。在转录调控过程中，除了需要调控区外，还需要反式作用因子。根据不同功能，常将反式作用因子分为以下三类：具有识别启动子元件功能的基本转录因子；能识别增强子或沉默子的转录调节因子以及不需要通过DNA-蛋白质相互作用就参与转录调控的共调节因子。 实验中，常将前两类反式作用因子统称为转录因子(transcription factor, TF),包括转录激活因子(transcriptional activator)和转录阻遏因子(transcriptional repressor)。这类调节蛋白能识别并结合转录起始位点的上游序列或远端增强子元件，通过DNA-蛋白质相互作用而调节转录活性，并决定不同基因的时间，空间特异性表达。 共调节因子本身无DNA结合活性，主要通过蛋白质-蛋白质相互作用影响转录因子的分子构象，从而调节转录活性。实验中常将与转录激活因子有协同作用的那一类共调节因子称为共激活因子， 所有共激活因子都能识别靶位点(启动子，增强子)，而靶位点的特异性则由DNA结合域的特定序列决定。DNA结合域结合在特定的序列上，从而将激活因子上的转录激活域带到基础转录区域附近。 在植物学相关领域，科研工作者利用相关原理构建出诱导型的含有标签的转化载体，首先，设计特殊的启动子，保证融合的转录因子(包括DNA结合域，转录激活域和受体调控域)组成型表达。一旦实验中加入化学小分子，该小分子与受体调控结构域相结合，导致融合表达的转录因子构象发生变化，由细胞质基质转移入核内。融合蛋白就能特异性识别相关的DNA结合域并与之结合，该蛋白的转录激活域就能激活相关基因高水平表达。(简单来说吧，就是一个转录因子，它有三个域：1，结合DNA的，2，结合RNA聚合酶的，3，结合调节一些化学调控因子的。加入某些化学小分子后转录因子被激活，进而激活基因表达。) 转录因子：识别TATA区的TF Ⅱ D，识别CAAT区的CTF,识别GGGCGG的SP1以及识别热激蛋白启动区的HSF。已知每个细胞中可含有约60 000个SP1，而CTF的含量则高达每个细胞300 000个。 反式作用因子是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。常见的DNA结合域包括碱性氨基酸结合域，酸性激活域，谷氨酰胺(Q)富含域，脯氨酸(P)富含域等。通常情况下，配体调节受体大多有DNA结合域和转录激活域。而甾醇类受体通常都是转录因子，其N末端都有保守的DNA结合域，C末端都有激素结合域。 1，螺旋-转折-螺旋(helix-turn-helix,HTH)结构(这个结构是要去结合DNA的) 这一类蛋白质分子中有至少两个α螺旋，中间由短侧链氨基酸残基形成"转折"，近羧基端的α螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋白在DNA双螺旋大沟中的结合。控制酵母交配型MAT基因座以及果蝇体节发育的调节基因(antp,ftz,ubx)等同源盒(homeobox)基因所编码的蛋白都有HTH结构。与DNA相互作用时，同源域蛋白的第一，二两个螺旋往往靠在外侧，其第三个螺旋则与DNA大沟相结合，并通过其N端的多余臂与DNA的小沟相结合。 同源域是指编码60个保守氨基酸序列的DNA片段，它广泛存在于真核生物基因组内，由于最早从果蝇 homeotic loci(该遗传位点的基因产物决定了躯体发育)中克隆得到而命名，同源转换基因与生物有机体的生长，发育和分化密切相关。许多含有同源转换区的基因具有转录调控功能，同源转换区氨基酸序列很可能参与形成DNA结合区。如下总结了部分含同源转换区转录因子所识别的DNA序列，Oct-1，Oct-2，与Pit-1/GHF-1所识别的核心序列仅有一个碱基之差，而果蝇en,ftz和ubx基因产物能识别完全相同的DNA序列。eve基因产物除识别与前者相同的序列外，还识别另一个靶序列。 Oct-1 和 Oct-2专一结合于启动子内8碱基区，它们都含有75个氨基酸的pou区和60个氨基酸的同源转换区。尽管Oct-1和Oct-2 中的同源盒与经典的果蝇同源转换区变异较大(60个氨基酸中只有20个相同，外加8个保守性替换)，该区在这两个蛋白质中却是高度保守的(60个氨基酸中有53个相同)。 2，锌指(zinc finger)结构 锌指结构家族蛋白大体可分为锌指，锌钮(twist)，锌簇(cluster)结构，其特有的半胱氨酸和组氨酸残基之间氨基酸残基数基本恒定，有锌参与时才具备转录调控活性。重复的锌指结构都是将一个α螺旋与一个反向平行β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸，精氨酸参与DNA的结合。 锌指结构中每一个α螺旋可以特异的识别3~4个碱基。利用不同的锌指结构识别特异DNA序列的特点以及核酸酶能够切断靶DNA的原理，科研工作者获得了一类被称为锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)的新型限制性内切核酸酶。根据改变锌指结构通用序列中7个 X序列就能识别不同的DNA序列这一特征，人工设计识别特异DNA序列的α螺旋，用TGEK作为螺旋间的连接序列，构建成对人工锌指结构域和Fok I 融合蛋白(ZFN)，就能在指定区域切断DNA双链。 3，碱性亮氨酸拉链(basic-leucine zipper)，即bZIP结构。肝，小肠上皮，脂肪细胞以及某些脑细胞中存在的一大类C/EBP家族蛋白，它们的特征是能够与CCAAT区和病毒的增强子结合。C/EBP家族蛋白的羧基端35个氨基酸残基具有能形成α螺旋的特点，其中每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，这就导致第7个亮氨酸残基都在螺旋的同一方向出现。 4，碱性-螺旋-环-螺旋(basic-helix/loop/helix)，即bHLH结构 在免疫球蛋白κ轻链基因的增强子结合蛋白E12与E47中，羧基端100~288个氨基酸残基可形成两个双性α螺旋，被非螺旋的环状结构所隔开， 转录活化结构域 在真核生物中。反式作用因子的功能由于受蛋白质-蛋白质之间相互作用的调节变得精密复杂，完整的转录调控功能通常以复合物的方式来完成，这就意味着并非每个转录因子都直接与DNA结合。因此，是否具有转录活化域就成为反式作用因子中唯一的结构基础。反式作用因子的功能具有多样性，其转录活化域也有多种，通常依赖于DNA结合结构域以外的30~100个氨基酸残基。不同的转录活化域大体上有下列几个特征结构： 1，带负电荷的螺旋结构 2，富含谷氨酰胺的结构 3，富含脯氨酸的结构利用顺式作用元件和反式作用因子间相互作用的原理，科研人员研发了许多调控基因表达的技术。其中最新的应用当属TALEN技术(TALEN=transcription activator-like effector+FokI nuclease fusion protein)，该技术利用转录激活因子34个氨基酸重复肽段中第12，13个氨基酸可以特异识别DNA方法碱基的特性，串联合成可识别目的碱基序列的TALE蛋白，与内切核酸酶FokI融合表达，可切割特异识别序列下游9~13bp，从而实现敲除指定内源基因的功能。 在真核生物中，发生在转录之前的，染色质水平上的结构调整，称之为基因表达的表观遗传调控。主要包括DNA修饰(DNA甲基化)和组蛋白修饰(组蛋白乙酰化，甲基化)两个方面。 分子生物学最新研究表明，在个体发育过程中，用来合成RNA的DNA模板也会发生规律性变化，从而调控基因表达和生物体的发育。 高度重复基因的形成通常与个体分化阶段DNA的某些变化有关。例如，一个成熟的红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的mRNA，而其前体细胞却不产生珠蛋白。许多情况下，这种变化是由于基因本身或其拷贝数发生了永久性变化。这种DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，包括基因丢失，扩增，重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。这些调控方式使基因组发生改变，与转录及翻译水平的调控不同。 1，"开放"型活性染色质(active chromatin)结构对转录的影响 真核基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定区域被解旋松弛，形成自由DNA。这种变化可能包括核小体结构的消除或改变、DNA本身局部结构的变化甚至从右螺旋型变为左螺旋型(Z-DNA)等，这些变化可导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA结合，诱发基因转录。。用DNA酶I处理各种组织的染色质时，发现处于活跃状态状态的DNA更容易被DNA酶I所降解。 研究发现，活跃表达的基因所在染色质上一般含有一个或数个DNA酶I超敏感位点(hypersensitive site),它们大多位于基因5'端启动区，少数在其他位置。而非活性基因的5'端相应位点却不表现对DNA酶I的超敏感性。有人用专一切割单链DNA的SI核酸酶处理该基因活跃表达的染色体DNA，证实有DNA被水解，说明该基因活跃表达时启动区部分序列可能解开成单链，从而不能继续缠绕在核小体上，使启动区DNA "裸露" 在组蛋白表面，形成对DNA酶I的超敏感现象。上述实时说明，超敏感位点的产生可能是染色质结构规律性变化的结果。正是由于这种变化，使DNA容易与RNA聚合酶和其他转录调控因子相结合，从而启动基因表达，同时也更容易被核酸酶降解。 有证据表明，存在"灯刷形"染色体(lamp brush)上的环形结构可能与基因的活性转录有关。 2，基因扩增 基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需求，是基因活性调控的一种方式。 3，基因重排与变换 将一个基因从远离启动子的地方移到距离它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。。。或将几个相距较远的基因片段通过染色体内DNA重组把几个相隔较远的基因片段连接在一起，从而产生具有表达活性的蛋白。 DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，这一修饰途径可能存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关。大量研究表明，DMA甲基化能关闭某些基因活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构，DNA构象，DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。 1，DNA甲基化 DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中。在染色体水平上，DNA甲基化在着丝粒附近水平最高；在基因水平上，DNA甲基化高水平区域涵盖了多数的转座子，假基因和小RNA编码区。甲基化似乎对于长度较短的基因有较强的转录调控能力，而对长基因的调控能力十分微弱。实验证明，这个过程不但与DNA复制起始及错误修正时的定位有关，还通过改变基因的表达参与细胞的生长，发育过程及染色体印迹，X染色体失活等的调控。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA,这里6都是上标)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列CpXpG,CCA/TGG和GATC中。因为高等生物CpG二核苷酸序列中的C通常是甲基化的，极易自发脱氨，生成胸腺嘧啶，所以CpG二核苷酸序列出现的频率远远低于按核苷酸组成计算得到的频率。由于这些CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，这段序列往往被称为CpG岛。 真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型甲基转移酶，另一种是从头合成型甲基转移酶，前者主要在家里化母链(模板链)指导下使处于甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化，该酶催化特异性极强，对半甲基化的DNA有较高的亲和力，使新生的半甲基化DNA迅速甲基化，从而保证DNA复制及细胞分裂后甲基化模式不变。后者催化未甲基化的CpG成为mCpG，它不需要母链指导，但速度很慢。这类甲基化酶是导致特异基因受甲基化调控的主要因子，在基因表达的变观遗传学研究中有十分重要的地位。 2，DNA甲基化抑制基因转录的机理 DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。研究表明，当组蛋白H1与含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分别形成复合体时，DNA的构型存在很大的差别，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。人们用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合，从而降低其体外转录活性。 5-甲基胞嘧啶在DNA上并非随机分布，基因的5'端和3'端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关。对于弱启动子来说稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性。当这一类启动子被增强时(带有增强子)，即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。若进一步提高甲基化密度，即使增强后的启动子仍无转录活性。因为甲基化对转录的抑制强度与MeCP1(methyl CpG-binding protein 1)结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。 DNA甲基化还提高了该位点的突变频率。 3，DNA甲基化与X染色体失活 X染色体失活是发育过程中独特的调节机制。雌性胎生哺乳动物中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。 组蛋白乙酰化对基因表达的影响： 1，组蛋白的基本组成：组蛋白(histone)是组成核小体的基本成分，核小体(nucleosome)是组成染色质的基本结构单元。核小体由组蛋白八聚体(由两个包含H2A,H2B,H3,H4的四聚体组成)和缠绕两圈的DNA组成。在相邻的核小体之间有一个20~200bp的间隔区，在电子显微镜下，一列核小体看上去像一串珠子，每个珠子的直径大约是10nm。另一个组蛋白H1结合在核小体核心之外，起到稳定核小体序列和染色质的高级结构的作用。 2，核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化 核心组蛋白朝向外部的N端部分被称为"尾巴"，可被组蛋白乙酰转移酶和去乙酰转移酶修饰，加上或去掉乙酰集团。如下图是已报道的组蛋白N端"尾巴"主要被修饰位点。 3，组蛋白乙酰基转移酶 催化组蛋白乙酰化反应的组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)。目前已发现的HAT主要有两类：一类与转录有关，另一类与核小体组装以及染色质的结构有关。HAT并不是染色质结合蛋白，但是可以通过与其他蛋白相互作用来影响染色质的结构。许多转录激活因子都有HAT活性，与转录有关的HAT催化亚基是酵母调控蛋白质GCN5的同源物，而GCN5本身具有乙酰化组蛋白H3和H4的活性。 TAF Ⅱ 250组蛋白乙酰转移酶是TF Ⅱ D 复合物的一个亚基它的主要功能是与启动子结合协助起始转录，能使组蛋白H3和H4乙酰化。转录共激活子PCAF也能使这两个组蛋白乙酰化。组蛋白乙酰转移酶p300/CBP也是转录共激活子，通过与增强子结合蛋白相互作用来调节转录，能使组蛋白H2A,H2B,H3,H4乙酰化。与激素受体协同作用的转录共激活子ACTR也是一种作用于H3和H4的组蛋白乙酰转移酶。 4，组蛋白去乙酰化 组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)负责去除组蛋白上的乙酰基团，目前研究比较深入的是人类中的HDAC1和酵母中的Rpd3。HDAC和Rpd3都形成很大的蛋白复合体发挥作用。Rpd3能特异性去除组蛋白上的乙酰基团，使核小体相互靠近，并在转录共抑制子Sin3及R的协同作用下，抑制基因转录。 5，组蛋白乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响 组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶通过使组蛋白乙酰化和去乙酰化对基因表达产生影响。组蛋白N端"尾巴"上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质相结合的变化，从而提高了基因转录的活性。 组蛋白甲基化对于真核基因表达的调控 基因沉默(又称RNA沉默，RNA silencing)是指真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除细胞中非正常RNA的一种机制。通常情况下基因沉默可以分为转录水平基因沉默(transcriptional gene silencing)和转录后水平基因沉默(post-trancriptional gene silencing) RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的技术。由于RNAi技术可以特异性降低或关闭目的基因表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和疾病的基因治疗领域。 1，干扰小RNA(small interfering RNA,siRNA)： 实验表明，双链RNA对内源基因表达的干扰效率远高于单链的RNA，真正起到RNA沉默作用的应该是双链RNA。此外，研究还发现，引入的外源RNA只对同源基因有高沉默效率，暗示它们之间可能需要形成配对的基础。2000年，RNAi研究有了重要进展，揭示了dsRNA介导的RNAi现象的许多重要特性。研究者开发了一套基于果蝇细胞提取物的体外RNAi研究系统，发现无论是否有靶mRNA的存在，引入的外源dsRNA的正义，反义链都会被切割成21~23nt的小片段，相对应的靶mRNA也会被降解成长度差为21~23nt的片段，说明这种降解很可能是由21~23nt小片段介导的，并且这种降解需要ATP提供能量。现在，已统一将介导这种沉默现象的小片段RNA称为干扰小RNA(small interfering RNA,siRNA)。 2，siRNA的生物合成 病毒RNA以及由环境，实验因素引入的外源RNA都可能是siRNA的来源。此外，基因组重复片段，转座子等序列也可能产生siRNA。通常一个长为21nt的双链小RNA，其中19nt形成配对双链，3'端各有两个不配对核苷酸序列而5'端为磷酸基团。其中一条链为引导链(guide strand)，介导mRNA的降解；另一条链为乘客链(passenger strand)，在siRNA形成有功能的复合物前被降解。 siRNA的产生过程主要包括着3个核心步骤：1，经Dicer切割形成双链小片段； 2，组装复合物； 3，形成有活性的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC) (1)Dicer切割 Dicer是一类RNase Ⅲ 蛋白，主要包括一对RNase Ⅲ 结构域，双链RNA结合域，解旋酶结构域和PAZ结构域。PAZ结构域可以结合双链RNA的两个3'不配对核苷酸。两个RNase Ⅲ 结构域形成分子内二聚体结构，各催化剪切一条链，产生双链断裂。结构生物学研究表明，PAZ结构域和 RNase Ⅲ 催化切点约相距6.5nm，与20多个核苷酸的长度相当，因此，Dicer本身可以作为一把裁剪的尺子，用来切出长为21~23nt的siRNA。 (2)R2D2的装配 siRNA的装载需要双链RNA结合蛋白R2D2的帮助。R2D2包含两个一前一后的双链RNA结合结构域，有报道认为R2D2可以结合双链小RNA热稳定性较高的一端。 (3) RISC的装配和成熟 。。。 miRNA 真核基因其他水平上的表达调控 蛋白质磷酸化对基因转录的调控
1．DNA是遗传物质的两个重要试验的主要步骤？答：（1）Griffith及Avery细菌发生遗传转化试验证明了DNA是病毒的遗传物质，其具体步骤为：首先用活S型肺炎链球菌感染小鼠，小鼠死亡，而活R型感染，小鼠不死接着用灭活的S型和R型感染小鼠，结果都不致死；但是用灭活的S型和活R型混合感染小鼠，小鼠死亡，解剖小鼠发现有活的S型致病菌，分离死S型细菌各组分与活R型混合感染小鼠，发现只有S型DNA能使R型细菌发生转化，获得致病力，此实验证明DNA就是遗传物质。（2）Hershey用噬菌体感染细菌的试验证明DNA是细菌的遗传物质。其具体步骤为：在含有放射性标记的35S和32P的氨基酸或核苷酸培养液中培养噬菌体，获得含放射性标记的噬菌体，用这些放射性噬菌体感染无放射性大肠杆菌，经过1-2次传代后，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但还有30%的32P标记说明在传代过程中发挥作用的是DNA而不是蛋白质。2、简述中心法则的主要内容？(1) DNA序列是遗传信息的贮存者，通过自主复制得到永存；(2) DNA通过转录生成RNA;(3) 含遗传信息的mRNA通过翻译生成蛋白质来控制生命现象；(4) 同时某些RNA可以通过逆转录将遗传信息传到DNA；(5) 某些RNA自身还可进行复制使其遗传信息得以永存。1、 原核和真核生物在基因组DNA结构上有哪些差异？原核：（1）基因组较小，环状双螺旋DNA与DNA结合蛋白结合成带有单拷贝基因的单染色体（2结构简练几乎全部由功能基因和调控序列组成，几乎每个基因序列都与其所编码的蛋白质呈4）有些原核生物基因组内存在基因重叠现象，但编码序列一般不重叠。（5）基因是连续的，没有内含子。真核：（1）线性DNA与组蛋白结合形成染色体形式一般有多条。（2） 数量庞大含有大量重复序列（3）基因组中多数为非编码序列 （4含有割裂基因 （5具有多态性（6转录产物为单顺反子 （5）具有端粒结构2、作为遗传物质应该具备哪些特性？为什么说DNA适合作为遗传物质？遗传物质特性：贮存并表达遗传信息，能把信息传递给子代，物理和化学性质稳定，具有遗传变化的能力DNA特性：各异的碱基序列储存大量的遗传信息，DNA的复制是其表达和传递遗传信息的基础，通过磷酸二酯键相连，形成双螺旋结构，生理状态下物理、化学性质稳定，有突变和修复能力，可稳定遗传是生物进化的基础。3、简述DNA双螺旋结构的主要特点双链反向平行，具有5‘-3’极性，围绕中轴，螺旋盘旋，磷酸，脱氧核糖为骨架，以磷酸酯键相连，位于外侧，碱基互补配对，以氢键相连，位于内侧，大沟，小沟交替出现。4、简述真核染色体的组装过程DNA链盘绕由H2A,H2B，H3,H4组成的组蛋白八聚体核心形成念珠状结构的核小体，两端由H1封阻。核小体之间以DNA链连接，形成10nm纤丝状结构，螺旋后形成30nm螺纹管结构，折叠盘绕形成染色体。5、影响DNA稳定性的因素有哪些氢键，磷酸酯键，0.2 M Na+ 生理盐条件，碱基堆积力 (范德华力) ，疏水作用力6、请问哪些条件可促使DNA复性(退火) 降低温度、pH值和增加盐浓度可以促进DNA复性(退火) 7、影响Tm的因素有哪些（1）在 A, T, C, G 随机分布的情况下 ，决定于GC含量，GC含量越高，Tm越大（2）GC%含量相同的情况下， AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小（3）对于大片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关（4）对于小片段，片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小（5）变性液中含有尿素，甲酰胺等可降低Tm（6）盐浓度和PH值也会影响Tm1、简述原核和真核DNA复制的特点？（1）原核为单复制起点，真核为多复制起点（2）原核复制子大而少，真核复制子小而多（3）真核复制起始受许可因子的控制 （4）真核复制叉移动的速度快，原核速度慢（5）真核冈崎片段小，原核大（6）真核复制存在端粒和端粒酶（7）真核原核DNA聚合酶种类，结构，作用上有差异（8）真核生物DNA复制的起始需要起始原点识别复合物（ORC）参与2、线性DNA如何解决末端复制的问题？（1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。（2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。（3）DNA可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有游离末端。（4）末端是可变的，而不是精确确定的。3、列举参与DNA复制过程中的主要酶及其功能解旋酶：解开双螺旋，推动复制叉向前延伸SSB：使DNA单链保持一种伸展 构象，作为模板；使解开的单链不形成发卡结构；保护DNA单链不受Dnase水解螺旋酶：消除正超堆积，减少能量需求，有利于DNA解链引物酶：合成的引物，减少致死突变。 DNA连接酶：催化双链DNA上的单链断点的5’-与3’-生成磷酸二酯键，封闭DNA双链断点DNA聚合酶：聚合作用 ，3’→5’外切酶活性（校对作用），5’→3’外切酶活性（切除修复作用） 4、请以原核生物为例，说明DNA复制的过程起始蛋白复合体与DNA链复制起始点结合，在解旋酶和单链结合蛋白作用下解旋，启动复制起始起始形成的复制引发体在后随链上合成多个RNA引物，DNA聚合酶以核苷酸为底物延伸前导链和后随链。后随链合成的不连续冈崎片段用DNA连接酶连接复制到达复制终止序列，在终止蛋白作用下终止复制。5、DNA复制过程中如何保证其遗传信息传递的忠实性？（1）碱基配对原则（2）DNApol的3’?5’外切酶活性（校正） （3）DNApol只能从引物的3’ 端延伸DNA（切除），需要RNA引物，而RNA引物最终被降解而避免错误（4）半不连续机制，有利于错配碱基的校正（5）修复系统有多种机制和酶6、DNA连接酶对于DNA的复制是很重要的，但RNA的合成一般却不需要连接酶。解释这个现象的原因在DNA复制时，连接酶对于后随链的合成是重要的，因为它能将冈崎片段的5’端与它前面的另一条链的3’端连接起来。RNA的合成既能以DNA为模板(RNA聚 合酶活性)，又能以RNA为模板(RNA复制酶活性)；相应的，先导链的合成沿着5’→3’方向进行，不需要连接酶。7、解释在DNA复制过程中，后随链是怎样合成的因为DNA聚合酶只能朝着5’→3’的方向合成DNA，后随链不能象前导链那样总是朝着同一方向合成，滞后链是以大量独立片段的形式(冈崎片段)合成的，每个片段都是以5’→3’方向合成，这些片段最后连在一起形成一连续的多核苷酸链。每个片段都独立地被引发，聚合和连接1、列出真核生物mRNA与原核生物mRNA的区别：原核生物mRNA的半衰期短，多以多顺反子形式存在，5′端无帽子结构，3′端没有或有较短的polyA尾巴。单在原核生物起始密码上游具有能与核糖体16SrRNA3′端反向互补的序列，称SD序列。原核生物mRNA的起始密码子有AUG、GUG和UUG三种。转录和翻译在同一区域进行真核生物mRNA半衰期相对较长，多以单顺反子形式存在，5′端有GTP倒扣形成的帽子结构，3′端有较长的polyA尾巴。只有AUG一种起始密码子。转录在核内而翻译在核外进行。 2、概括说明σ因子对启动子调节的辅助功能。σ因子是RNA聚合酶的别构效应物，能增加聚合酶对启动子的亲和力，同时降低聚合酶对非启动子区的亲和力。由于同一个聚合酶可以和几种不同σ因子结合，故可利用选择不同的σ因子起始不同的基因转录。 3、列举原核生物同真核生物转录的差异？（1） 原核生物转录只有一种RNA聚合酶，真核生物转录根据转录产物不同而由多种RNA聚合酶。（2） 原核生物的启动子具有极高的同源性，而真核生物的启动子差异较大 （3）原核生物的转录产物是多顺反子mRNA，而真核生物的转录产物是核不均一RNA，需转录后修饰加工。4、概括典型原核生物启动子的结构和功能，并解释什么是保守序列？启动子是RNA聚合酶结合和转录起始的特殊序列。典型的原核生物启动子大约40个核苷酸，并由两个重要的序列： －10区，pribnow box，TATA，和－35区TTGACA，是RNA聚合酶的结合位点。保守序列指所有启动子的该部位都有这一序列或十分相似的结构。5、真核生物启动子的基本结构包括哪些部分？分别有何功能？真核生物启动子包含核心启动子元件和上游启动子元件两部分。核心启动子元件即TATA box，其功能是使转录精确的起始。上游启动子元件包括CAAT box 和GC box，其功能是控制转录起始的频率。6、增强子是如何增强转录的？通过影响染色质DNA－蛋白质结构或改变超螺旋密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与模板DAN结合，起始基因转录。7、添加PolyA尾巴的信号序列是什么？简述尾巴结构的生理意义基因3′末端转录终止位点上游15～30bp处的保守序列AATAAA生理意义：保持mRNA的稳定性，防止被降解；与翻译起始有关8、简述转录的常规特点（1）在依赖DNA的RNA聚合酶作用下进行转录（2） A＝U、C≡G 合成RNA分子（3） 转录合成RNA链的方向为5’→3’，模板单链DNA的极性（4）方向为3’→5’， 而非模板单链的极性方向与RNA链相同，均为5’→3’。书写） （5）基因转录方式为不对称转录(一条单链DNA 为模板,RNA聚合酶的结合)9、RNA酶促合成的基本特征(1) 双链DNA分子以单链为模板；(2) 不需引物；(3) 底物是5`-核苷三磷酸（NTP）；(4) 前一个碱基的 3`-OH和后一个碱基的 5`-P反应，形成磷酸二酯键，RNA链延伸；(5) RNA碱基顺序由模板DNA顺序决定； (6) RNA合成方向是从5`→3`，新生RNA与模板DNA链呈反向平行；9、简述ρ因子依赖性终止子的作用机理ρ因子结合：最初结合到RNA终止子上游一个伸展的（约70个核苷酸）单链区。ρ因子移动：结合到RNA上后，发挥ATP酶活性以提供在RNA上滑动的能量，直到它到达RNA-DNA杂合链区域(可能ρ因子沿RNA移动比聚合酶沿DNA移动的速度快)，终止：ρ因子发挥解旋酶活性，使双链体结构10、比较真核生物与原核生物转录起始的第一步有什么不同细菌中，DNA指导的RNA聚合酶核心酶由四个亚基组成(两个α亚基，一个β亚基，一个β’亚基)，核心酶与σ亚基结合产生全酶。核心酶可以催化NTP的聚合，但只有全酶能够引发转录的开始。主要的步骤是：具有特异识别能力的。亚基识别转录起，始点、上游的启动子特异同源序列，这样可以使全酶与启动子序列结合力增加，形成封闭的二元复合物。关键的作用是RNA聚合酶与DNA的相互作用。真核生物中，当含TBP的转录因子与DNA相互作用时，其他因子也结合上来，形成起始复合体，这一复合体再与RNA聚合酶结合，因此主要是RNA聚合酶与蛋白质之间的作用。 11、 转录涉及模板链和编码链的分离，解释在转录中单链DNA是怎样被保护的转录过程中控板与编码链分离时，聚合酶覆盖了整个转录泡——从解旋位点到螺旋重新形成位点，因此单链的DNA被保护起来。与复制不同，转录不需要单链结合蛋白的参与。 12、 概括说明σ因子对启动子调节的辅助功能σ因子(除了RpoN)有识别启动子序列的结构域。作为游离的蛋白质；σ因子并不具备与DNA结合的构象。当σ因子与核心酶结合后构象发生改变，其N末端游离出与DNA结合的结构域。σ因子的这一调节方式是为了防止游离的σ因子与启动子区结合，而阻碍了依赖于全酶的转录启动。另外，这样也可防止形成全酶的σ因子的浓度被稀释，因为每一个细胞中，大约每三个核心酶对应于一个σ因子。 13、为什么只有DNA双螺旋中的一条链能被正常的转录? 如果两条链都被转录，每个基因就能编码两个不同的多肽14、原核生物的核糖体RNA和DNA相对较稳定并且半衰期而mRNA却不稳定很快被降解请解释这种稳定性的差异 如果转录物的寿命很长，就不可能通过控制mRNA的合成速率来调节基因的活性。另一方面，如果tRNA和rRNA的寿命长的话，就更合算。 15、启动子有何作用特点（1）一个基因可同时拥有一个及以上启动子 （2）启动子位置不定，一般在转录起始点上游。 （3）可与增强子共同控制转录起始和强度。 （4）发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用16、增强子有何作用特点① 可增强效应十分显著； ② 增强效应与其位置和取向无关； ③ 大多为重复序列；④ 一般具有组织或细胞特异性； ⑤ 无基因专一性； ⑥ 许多增强子还受外部信号的调控17、如何通过实验确定启动子与增强子边界及关键序列元件边界序列确定:从一段特定的含有启动子的DNA片段入手，从DNA的两侧不断缩短长度直至短到停止产生活性的某一位置。保守序列确定：A: 对已知启动子序列，可通过缺失或突变确定哪些碱基为必需； B: 还可通过比较不同的启动子间的同源性，确定哪些序列为保守序列。18、回答大肠杆菌RNA聚合酶各亚基生物学功能β和β’共同组成了酶的催化中心。它们的序列与真核生物RNA聚合酶的最大亚基相关。β亚基可能是酶和核苷酸底物结合的部位。β’亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。α亚基的功能可能是识别其相应的启动子。原核生物σ因子的功能：帮助核心酶辨认启动子；解开DNA的双螺旋 I型内含子发生改变后，可以产生其他酶的活性吗?如果可以，是哪些活性?这意味着I型内含子的催化中心有什么特点？ 可以。这些活性包括：RNA聚合酶、内切核酸酶、磷酸酶、连接酶的活性将I 型内含子转变成这些酶的能力表明它能结合于RNA的糖—磷酸骨架并能催化在它前后的几个不同反应。例如，连接是剪切的相反反应 1、列举核糖体上主要的活性位点，并解释起功能(1)mRNA结合位点—30S头部：防止mRNA链内碱基结合，促进mRNA与小亚基结合(2)肽酰－tRNA位点—P位点：结合起始rRNA，增强A位活性(3)氨酰基 tRNA 位点—A位点：结合特定氨酰tRNA(4)脱酰基tRNA和多肽的逐出位点—E位点：E1为脱酰基tRNA 离开核糖体提供出口；E2对蛋白质合成的准确性起重要作用；E3为多肽离开核糖体提供出口其他位点：结合起始，延伸等因子(5)5s rRNA位点（与tRNA进入有关）;(6)EF—Tu（延伸因子）位点 ：位于大亚基内，与氨酰基 tRNA的结合有关;(7) EF—G :转位因子结合位点,位于大亚基靠近小亚基的界面处 2、简述蛋白质生物合成的基本过程1）起始：核糖体小亚基识别起始位点，在起始因子作用下，与大亚基，氨酰tRNA结合，形成起始复合物 2）延伸：核糖体在mRNA移动，在延伸因子作用下，通过转移肽酰tRNA到氨酰tRNA，即经过进位，肽键形成和转移，脱落，移位的循环至终止密码子完成肽链延伸3）终止：在释放因子作用下，识别终止密码子，肽链从tRNA上释放，核糖体离开mRNA3、什么是摇摆假说?在蛋白质生物合成中转移核糖核酸反密码子的5′位碱基不严格的特异性的假说。允许反密码子的5′位(第一位)碱基与信使核糖核酸的密码子3′位(第三位)碱基通过改变了的氢键配对(如非G-C、A-U 配对)，从而识别一种以上的密码子 4、指出E.coli和真核生物翻译起始的不同[1]翻译的起始识别原核的起始tRNA是fMet-tRNA，存在SD序列和核糖体结合序列作为翻译起始位点，真核生物利用eIF4不同结合位点结合帽子和尾巴结构，识别起点。 [2]翻译起始：原核生物30s小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNA结合，最后与50s大亚基结合。真核中起始tRNA是 Met-tRNA，40s小亚基首先与Met-tRNA(Met上角标）相结合，再与模板mRNA结合，最后与60s大亚基结合生成起始复合物，且真核生物的起始因子较多。 5、 N-甲酰甲硫氨酸-tRNA的功能是什么? 作为起始氨酰tRNA，能够识别AUG和GUG作为起始密码子，与IF-2结合成复合体进入小亚基的P位点6、解释核糖体肽基转移反应 肽基转移酶的活性区位于大亚基，临近肽酰tRNA的氨基酸茎，核糖体P位点和A位点。50S上肽酰转移酶催化P位的肽（氨）酰-tRNA把肽（或氨酰基）转给A位的AA-tRNA，并以肽键相连的过程 7、简述真核细胞中翻译终止的过程 由于氨酰tRNA上没有反密码子能够与三个终止密码子互补配对，因此翻译终止。终止需要tRNA的协助，此时没有氨基酸能够连接到位于P位点的肽酰tRNA上，释放因子有助于终止的发生，能使tRNA上的氨基酸C端不需要转肽基和脱酰基而发生转位。新生肽直接从P位点离开核糖体。8、真核与原核核糖体的主要区别是什么? 真核细胞80S核糖体中核糖体蛋白和rRNA数量和体积比原核细胞70S核糖体的大，真核大小亚基（40S和60S）均比原核细胞的大（30S，50S）。原核细胞的RNA含量比真核高，原核细胞核糖体有E位点便于脱酰tRNA的离开。原核中多以多聚核糖体形式存在，真核大多与细胞骨架和内质网膜结合10、密码子具有哪些特性（1）连续性：肽链合成起始后，密码子按3个一框读下去不重叠也不跳格，直到终止(2)简并性：许多氨基酸对应的密码子不止一种(3)兼职性：AUG（Met)和GUG（Val)两个密码子除代表特定氨基酸外，还兼作起始密码子(4)普遍性：各物种体内体外都适用(5)密码子-反密码子识别的摇摆性：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，而第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”。简述信号肽作用机制信号肽便被信号识别颗粒(SRP)识别，SRP与携带新生链的核糖体结合而停止翻译SRP再与内质网上的船坞蛋白(DP)结合翻译阻滞逆转，并使正在延伸的肽链转移到内质网腔内，信号肽被切除。 新生肽进入ER腔之后经折叠，修饰（糖基化和羟基化等）后运送到其它的部位。1、酵母双杂交系统原理不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能 ，酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用2、酵母单杂交原理将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。3、简述DNA重组的基本过程？（1）目的基因的提取：供体生物基因或称外源基因的提取（2）限制性酶切：目的基因切成不同大小片段（3）酶接：连接到另一DNA分子上-克隆载体（4）转化：重组DNA分子转入受体细胞（5）筛选和鉴定：对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定（6）基因表达：进行培养，检测外源基因是否表达4、凝胶电泳的工作原理与应用原理：1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移； 2）电泳中使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子大小、介质粘度等成反比； 因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。应用：分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，分子克隆技术核心技术5、分子杂交的试验流程以及分类样品及探针制备--样品电泳分离---转膜----预杂交-----杂交----洗膜----分析（压片、显色、荧光观察等）分类： Southern blot ， Northern blot，Western blot，ISH， FISH6、简述DNA足迹试验的原理与应用 DNA结合蛋白结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带 7、简述凝胶阻滞试验的原理 原理：蛋白质与DNA结合后分子质量将增加，在电泳中移动的速率减小，没有结合蛋白的DNA片段迁移速率大。利用这一原理可分离纯化细胞提取物中特定DNA结合蛋白 8、简述PCR的工作流程，原理与应用 原理：利用DNA复制的半保留复制和DNA变性与复性的特性，用特异性引物对模板DNA进行指数扩增。 流程：首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是这种循环的不断重复。使DNA扩增量呈指数上升。 应用：基因组中特异片段克隆，不对称PCR，反向PCR，基因的体外诱变，RT-PCR，免疫PCR，基因组的比较研究 9、基因克隆的主要载体有哪些？ 质粒载体，噬菌体载体， BAC，克隆载体，表达载体，YAC，粘粒等 10、作为表达载体应具备哪些特点？ （1）能自主复制；（2）具有一个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；（3）有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； （4）分子量小，以容纳较大的外源DNA。 11、作为DNA重组应用较多的限制性内切酶II，其有哪些特点？ （1）识别位点严格专一；（2）识别序列的碱基数一般为4，6，8个bp；（3）识别位点经常是一种回文序列的DNA；（4）仅需 Mg2+ 作催化反应辅助因子，能识别双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异片段；（5）种类繁多，应用广泛 12、简述基因组文库的构建方法 ①用适当的限制性内切酶消化基因组DNA，以得到约20kb的片段；②用限制性内切酶切割载体DNA，使其形成与外源DNA相匹配的粘性未端；③用适当的方法除去l噬菌体裂解生长非必需的内部片段；④l噬菌体载体臂与外源DNA片段连接；⑤利用体外包装系统进行噬菌体的组装；⑥重组噬菌体侵染E. coli，每一克隆中含有外源DNA的一种片段，全部克隆构成一个基因文库。 13、简述cDNA文库的构建方法 ①mRNA的提取和纯化。②合成cDNA第一链。③将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。④将双链cDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。⑤将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖 14、怎样筛选目的基因？ （1）核酸杂交（2）PCR筛选（文库，菌落）（3）免疫筛选【解释】 15、基因组文库与cDNA文库有哪些差异？ （1）cDNA文库 包含着细胞全部mRNA信息，基因组文库 包含有生物全部的基因。 （2）cDNA文库具有组织细胞特异性，基因组文库无。 （3）cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。 （4）基因组文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA 1、乳糖操纵子阻遏蛋白的负性调控机制 没有乳糖时，1ac操纵子处于阻遏状态。I 基因在自身的启动子PI 控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合。 当有乳糖存在时，乳糖与R结合，使R四聚体解聚成单体，失去与o的亲和力，与o解离，基因转录开放。 2、乳糖操纵子CAP的正性调控机制 cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖供给能量时，cAMP含量降低；无葡萄糖时，cAMP含量升高。 cAMP与CRP结合变为CAP，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。 1ac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。 3、乳糖操纵子结构特点 大肠杆菌乳糖操纵子包括：结构基因：Z、Y和A,调控元件：启动子(P)、操纵区(O)和cAMP-CRP结合位点;调节基因：lacI 4、解释细菌对葡萄糖和乳糖的利用机制 1）．当葡萄糖存在，乳糖存在时：尽管乳糖作为诱导剂和阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白与操纵序列O解离。但由于cAMP浓度较低，cAMP和CRP结合受阻，基因处于关闭状态。2）．当葡萄糖和乳糖都不存在时：CRP可以发挥正调控作用，但由于没有诱导剂，阻遏蛋白的负调控作用使基因仍处于关闭状态。3）．当葡萄糖存在，乳糖不存在时：此时无诱导剂存在，阻遏蛋白与DNA结合。而且由于葡萄糖的存在，CRP也不能发挥正调控作用，基因处于关闭状态。 4）．当葡萄糖不存在，乳糖存在时：此时CRP可以发挥正调控作用，阻遏蛋白由于诱导剂的存在而失去负调控作用，基因被打开，启动转录。 5、色氨酸操纵子的阻遏蛋白的负调节机制 细菌通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸。合成色氨酸所需酶类的基因E、D、C、B、A，受其上游调控蛋白R基因的调控。R并没有与O结合的活性，只有当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合后而活化，能够与O结合，阻遏结构基因的转录，使基因开 ---关。
一、真核基因组的结构特点:
1.编码序列所占比例远小于非编码序列。
2.高等真核生物基因组含有大量的重复序列。
3.存在多基因家族和假基因。
4.基因通过可变前接能改变蛋白质的序列。
5.真核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体。
二、半保留复制的概念。
1.DNA复制时除代DNA双螺旋解开成为两条单链。
2.自作为模板按照碱基配对规律合成-条与模板相互补的新链，形成两个子代DNA分子。
3.每一个子代DNA分子中都保留有一条来自亲代的链。
三、半不连续复制。
1.DNA双螺旋结构中两股单链反向互补平行，一股链的方向为5' →3',另一股链的方向为3'→5'。
2.复制时合成的互补链方向则对应为3'→5和5'→3' ,而生物体内DNA的合成方向只能是5'→3’。
3.复制时,顺着解链方向生成的一股子链其合成方向与解链方向相同，合成能连续进行，称为前导链。
4.而另一股子链的合成方向与解链方向相反，它必须等待模板链解开至一定长度后 才能合成一段 ,然后又等待下一段模板暴露出来再合成合成是不连续进行的，称为后随链。
5.这种前导链连续复制而后随链不连续复制的方式称为半不连续复制。在复制中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段。
四、真核生物的DNA聚合酶a、β、γ、δ、ε。
1.DNA聚合酶δ是复制中最重要的酶，主要负责子链的延长，相当于原核生物的DNA聚合酶Ⅲ。
2.DNA聚合酶a主要催化合成引物。
3.聚合酶β、ε参与染色体DNA的损伤修复。
4.聚合γ复制线粒体DNA。
五、DNA复制是如何实现高保真性的。
生物体至少有3种机制实现复制保真性:
①严格遵守碱基配对规律:A-T配对，G-C 配对。
②聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能:原核生物DNA pol Ⅲ对嘌呤不同构型表现不同亲和力，从而实现其选择功能。
③复制出错时有即时校对功能:在复制过程中一旦DNA新生链3'端出现与模板错误配对的碱基时，DNA聚合酶I即能迅速识别，并利用3'→5'核酸外切酶活性切除错配的核苷酸，然后再通过其5’→3’聚合酶活性连接正确配对的核苷酸。此过程称错修复。
六、原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白。
解链过程主要由DnaA、B、C三种蛋白质共同参与。还有DnaG、SSB、拓扑异构酶。
1.DnaA蛋白辨认并结合于串联重复序列上(AT区),几个DnaA蛋白相互靠近形成DNA蛋白质复合体结构，可促使AT区的DNA进行解链。
2.DnaB蛋白(解旋酶)在DnaC蛋白协同下,结合并沿解链方向移动，解开双链,并置换出DnaA，初步形成复制叉。
3.解链的同时SSB结合在解开的单链上,保护单链模板。
4.DnaG(引物酶):催化RNA引物生成。
5.在解链过程中由拓扑酶来理顺DNA链。DNA拓扑异构酶II把DNA由正超螺旋变为负超螺旋,更好地起模板作用。
七、逆转录酶的三大活性。
1.RNA指导的DNA聚合酶活性。
2.DNA指导的DNA聚合酶活性。
3.RNase H 活性，作用需Zn²+为辅助因子。
八、从单链RNA到双链DNA的生成可分为三步。
1.逆转录酶以病毒基因组RNA为模板,催化dNTP聚合生成DNA互补链,产物是RNA/DNA杂化双链。
2.杂化双链中的RNA被逆转录酶中有RNase活性的组分水解，被感染细胞内的RNase H也可水解RNA链。
3.RNA分解后剩下的单链DNA再用作模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链。
九、重组修复。
当DNA双链断裂时,需要重组修复。重组修复是指在重组酶系的作用下,将另一段未受损伤的DNA移到损伤部位,提供正确的模板,进行修复的过程。“边修复,边复制”。
1.同源重组修复:参加重组的两段双链DNA在大于200bp的范围内序列相同，修复后的序列正确。大肠杆菌和酵母在同源重组修复中起关键作用的是ReoA蛋白。
2.非同源末端连接的重组修复:参加重组的两段双链DNA同源性低,修复后的序列中可存在错误，修复不精确。此方式是哺乳动物细胞DNA双链断裂的一种修复方式，起关键作用的是DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)和XRCC4。
十、简述原核生物的转录终止方式。
①依赖p因子的转录终止:p因子是一种蛋白质。当核心酶移动到终止子时，p因子与其结合并发挥解旋酶活性，解开DNA-RNA杂合双链,使新合成的RNA从模板链上脱落下来，转录终止。
②非依赖p因子的转录终止:核心酶沿模板移动到DNA的终止子序列时，按照该序列转录合成的RNA有两个特征:富含GC碱基对的发夹结构和一串U序列。
发夹结构可影响RNA与模板链的结合，并阻止核心酶前进;U序列则进一步降低RNA与模板链的结合力,从而使转录合成的RNA与模板链分离。随后核心酶与双链DNA解离,转录终止。
自考分子生物学不难，考生只要能够自觉对教材内容进行学习，复习的时候刷一刷真题，一般都能考过。 自考考前复习 第一，先用选择题的答案来积累知识点先老老实实把选择题、填空题，对应着答案，看（阅读），只求眼熟，不求背，一开始也背不上来吧。所以就这样看3次，记忆自然会出来。等你对10份卷子的知识点都形成了记忆，看到题目就能知道答案时，其实你已经有一个基本的知识系统了！这样比漫无目的去看课本积累知识点来得快。 第二，用计算题的答案来总结出解题步骤计算题，对着答案，看。把考点相同的题目抄到一起、不同的也抄下来、积累、总结。这样你就知道了，从xxxx年到xxxx年，计算题大概就是这几类，每一类的解题步骤是怎样的（这些步骤很重要必须记住）。然后就时常反复地按照你抄好的归类去看，也可以多抄几遍答案，尽可能记住有多少个类型题，而每个类型题又是按什么步骤答的。看到没有，计算题一点也不费力，就是考试的时候，把记忆的步骤默写上去，再套上考试题目的数据，自己算一遍而已。这完全比你看书本的公式，然后自己鼓捣怎么计算要快得多。 第三，用简答题的答案来补充、扩展、巩固知识点文字类的题也是一样的，相同的归纳，不同的也背下来，知道从xxxx年到xxxx年的文字类的题考了哪些，你不可能每一题都能背熟，但原则就是背得越熟越好、越多越好。自考/成考有疑问、不知道如何总结自考/成考考点内容、不清楚自考/成考报名当地政策，点击底部咨询官网，免费领取复习资料：
自考药学专业主要考中国近现代史纲要、马克思主义基本原理概论、英语(二)、计算机应用基础、计算机应用基础实践考核、有机化学(五)、分子生物学、物理化学(二)、药理学(四)、药理学(四)实践考核、药物分析(三)、药物分析(三)实践考核、药物化学(二)等。 药学专业学生毕业后的就业方向比较广泛，可以到制药厂和医药研究所从事各类药物开发、研究、生产质量保证和合理用药等方面的工作，药学专业就业方向也有很多人从事药品销售代理。药学专业就业岗位如医药代表、医药销售代表、销售代表、医院代表、招商经理、产品经理、地区销售经理、区域销售经理、学术专员、销售经理、地区经理、省区经理等。 自考毕业证颁发 高等教育自学考试学生的自学考试毕业证书由本省高等教育自学考试委员会与所属专业的主考校联合颁发。为体现国家考试的严肃性、权威性，自学考试的毕业证书由全国考委统一印制，并在中国高等教育学生信息网上电子注册。毕业证书可在教育部唯一学历证书查询网站中国高等教育学生信息（）查询，国家承认学历。自考/成考有疑问、不知道如何总结自考/成考考点内容、不清楚自考/成考报名当地政策，点击底部咨询官网，免费领取复习资料：
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大家都知道，医疗卫生行业对于个人能力要求比较高，药学专业则是主要对口药物方向的专业。一般都需要专业对口才能够从事。自考是学历提升的一种方式，其中也开设了药学专业供考生们选择。那么，自考药学专业需要学什么内容1、自考药学专业学习的内容医疗卫生行业由于发展的需要，各岗位对于人才的要求也越来越高，一些本来低学历的从事药物工作的上班族，都需要在提升学历之后才能够获得晋升空间。药学专业主要学习药物的相关知识，涉及到医学类的专业知识，以及最前沿的药物技术等。药物专业的考生未来可以选择到医院上班，也可以从事药物研发工作等。就业途径很多，可选择的工作岗位很广。2、自考药学专业考试科目自考药学专业考试科目有马克思主义基本原理概论、中国近现代史纲要、英语(二)、计算机应用基础(含实践)、有机化学(五)、分子生物学、物理化学、药理学(四)(含实践)、药物分析(三)(含实践)、药物化学(二)(含实践)、药剂学(二)(含实践)、数理统计、药事管理学(二)、药用植物与生药学。自考药学专业跟普通高等教育的药学专业一样，学习的主要内容就是了解药物基本知识以及药学行业的相关技术等。如果想了解更多关于自考药学专业的问题，可以点击咨询广东自考在线老师。
自考药学专业考试科目：药物化学(二)(实践)、药剂学(二)(实践)、药理学(四)(实践)、药物分析(三)、药物分析(三)(实践)、物理化学(二)、分子生物学、数理统计、药用植物与生药学、无机化学(三)、生物药剂及药物动力学、临床药物治疗学、毕业考核(或论文综合实践实验实习等)、计算机应用基础、药剂学(二)、药物化学(二)、药事管理学(二)、药理学(四)、有机化学(五)、中国近现代史纲要、马克思主义基本原理概论、英语(二)。 自考报名条件 1、凡具有本省正式户籍的公民，不受年龄、职业、学历的限制，均可就近报名并参加考试。外省在我省工作学习的人员，也可就近报名参加考试。 2、经国家教育部正式批准或备案的各类高等学校的专科毕业生，可直接申请报考本科段(独立本科段)。 3、考生专科(基础科段)、本科段(独立本科段)可同时兼报，但在领取本科毕业证书前必须先获取专科毕业证书。 4、实践性学习环节考核、毕业论文、毕业设计、毕业考核等，须按规定在本专业涉及实践课程理论考试全部合格后才能报考。 5、提倡在职人员按照学用一致、理论与实践相结合的原则选择报考专业。对某些行业性较强的专业(如公安管理、医学类专业等)将根据专业考试计划的要求限制报考对象。 自考网上报名流程 1、登录各地自考网上报名网站(新生需注册并填写相关资料，老生根据自己之前的账号进行登陆)。 2、到自考办网站规定的指定银行办理一张缴费用银行卡。 3、办理银行卡后的新生，和有银行卡的老考生按照报名网站规定的报名流程完成网上报名。 4、网上报名成功后的新生需要在规定时间到自考办指定的地点进行摄像制作准考证。自考/成考有疑问、不知道如何总结自考/成考考点内容、不清楚自考/成考报名当地政策，点击底部咨询官网，免费领取复习资料：
由于我本身是学计算机的，现在以及未来的研究方向主要是生物信息学。所以，仔细学习一下分子生物学很有必要，因为很多生物的实验原理以及生物学概念（转座子、增强子、顺式调控元件等等）在看论文的时候如果没接触过，很容易看的头大。因此本文面向的主要对象是计算机专业，研究生物信息等领域的初学者。 废话不多说了，我阅读的教材是朱玉贤的第4版，由于是从阅读到中间开始记录的。部分没有记录的章节要点稍后补全。 第5、6章主要讲常用的实验技术，对明白生物相关的论文为什么要做某些实验，以及在要找相关的数据的时候，用哪种实验的数据都很有帮助。 重组DNA通常是通过将特定DNA片段整合到病毒或者质粒等载体上，构成重组DNA，通过侵染或者注入等形式进入宿主细胞。使得宿主细胞得以表达某些DNA，通常的目的有：合成蛋白质，研究某些DNA的功能等。 重组DNA的必备原料有： 部分载体具有多克隆位点：即包含多个限制性酶切位点，他们是外源基因的插入部位，通过多克隆位点可以实现多种不同的DNA重组，如可以同时获得多种抗性。 蓝白斑筛选：DNA重组并得以在宿主内表达的菌落呈白色，而非转化的菌落呈蓝色。 细菌转化：将外源的DNA分子和载体进行重组后，需要将其送到宿主内，通常如大肠杆菌等对重组后的DNA吸收能力差，需要使用如氯化钙处理，才能够较好的吸收这些重组DNA，使其在宿主细胞内表达。 经过Cohen和Boyer等人的研究发现：某些高等生物如非洲爪蟾的基因，也可以通过DNA重组技术移到原核细胞（如大肠杆菌）中，并能够成功表达。 由于DNA链的多核苷酸呈阴离子状态，放在电场中，会向正极移动，移动的距离和构成DNA的核苷酸的数量相关（因为每个核苷酸带的电量基本是相同的），由于其带的电荷量以及分子大小的不同，在电泳中迁移的速率不同，迁移的距离也不同，故能够分离DNA片段。 通常凝胶对DNA片段的分辨能力与浓度有关。相同类型的凝胶，浓度越高，截止的空隙越小，对DNA分子的分布能力越强，就可以分离更小尺寸的DNA片段。反之，浓度越大，只能分离长度较大的片段。 对于超大DNA片段（>50kb），普通的琼脂糖凝胶电泳很难分离，因此发明了脉冲电场凝胶电泳。 PCR是体外快速扩增待定基因或DNA序列的常用方法，具体步骤如下： 基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR反应五要素：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、模板DNA和缓冲液（其中需要Mg2+）。
把书上的基本原理看懂就行，最基本的j就是dna复制，转录，翻译具体步骤，一些转基因操作啊，比如怎么获取目的基因，目的基因怎么和质粒连接，怎么电泳选择、各种筛选机制。关键就是死路得清晰，不要把复制需要的一些酶跟转录翻译搞混淆了。
一、真核基因组的结构特点:
1.编码序列所占比例远小于非编码序列。
2.高等真核生物基因组含有大量的重复序列。
3.存在多基因家族和假基因。
4.基因通过可变前接能改变蛋白质的序列。
5.真核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体。
二、半保留复制的概念。
1.DNA复制时除代DNA双螺旋解开成为两条单链。
2.自作为模板按照碱基配对规律合成-条与模板相互补的新链，形成两个子代DNA分子。
3.每一个子代DNA分子中都保留有一条来自亲代的链。
三、半不连续复制。
1.DNA双螺旋结构中两股单链反向互补平行，一股链的方向为5' →3',另一股链的方向为3'→5'。
2.复制时合成的互补链方向则对应为3'→5和5'→3' ,而生物体内DNA的合成方向只能是5'→3’。
3.复制时,顺着解链方向生成的一股子链其合成方向与解链方向相同，合成能连续进行，称为前导链。
4.而另一股子链的合成方向与解链方向相反，它必须等待模板链解开至一定长度后 才能合成一段 ,然后又等待下一段模板暴露出来再合成合成是不连续进行的，称为后随链。
5.这种前导链连续复制而后随链不连续复制的方式称为半不连续复制。在复制中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段。
四、真核生物的DNA聚合酶a、β、γ、δ、ε。
1.DNA聚合酶δ是复制中最重要的酶，主要负责子链的延长，相当于原核生物的DNA聚合酶Ⅲ。
2.DNA聚合酶a主要催化合成引物。
3.聚合酶β、ε参与染色体DNA的损伤修复。
4.聚合γ复制线粒体DNA。
五、DNA复制是如何实现高保真性的。
生物体至少有3种机制实现复制保真性:
①严格遵守碱基配对规律:A-T配对，G-C 配对。
②聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能:原核生物DNA pol Ⅲ对嘌呤不同构型表现不同亲和力，从而实现其选择功能。
③复制出错时有即时校对功能:在复制过程中一旦DNA新生链3'端出现与模板错误配对的碱基时，DNA聚合酶I即能迅速识别，并利用3'→5'核酸外切酶活性切除错配的核苷酸，然后再通过其5’→3’聚合酶活性连接正确配对的核苷酸。此过程称错修复。
六、原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白。
解链过程主要由DnaA、B、C三种蛋白质共同参与。还有DnaG、SSB、拓扑异构酶。
1.DnaA蛋白辨认并结合于串联重复序列上(AT区),几个DnaA蛋白相互靠近形成DNA蛋白质复合体结构，可促使AT区的DNA进行解链。
2.DnaB蛋白(解旋酶)在DnaC蛋白协同下,结合并沿解链方向移动，解开双链,并置换出DnaA，初步形成复制叉。
3.解链的同时SSB结合在解开的单链上,保护单链模板。
4.DnaG(引物酶):催化RNA引物生成。
5.在解链过程中由拓扑酶来理顺DNA链。DNA拓扑异构酶II把DNA由正超螺旋变为负超螺旋,更好地起模板作用。
七、逆转录酶的三大活性。
1.RNA指导的DNA聚合酶活性。
2.DNA指导的DNA聚合酶活性。
3.RNase H 活性，作用需Zn²+为辅助因子。
八、从单链RNA到双链DNA的生成可分为三步。
1.逆转录酶以病毒基因组RNA为模板,催化dNTP聚合生成DNA互补链,产物是RNA/DNA杂化双链。
2.杂化双链中的RNA被逆转录酶中有RNase活性的组分水解，被感染细胞内的RNase H也可水解RNA链。
3.RNA分解后剩下的单链DNA再用作模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链。
九、重组修复。
当DNA双链断裂时,需要重组修复。重组修复是指在重组酶系的作用下,将另一段未受损伤的DNA移到损伤部位,提供正确的模板,进行修复的过程。“边修复,边复制”。
1.同源重组修复:参加重组的两段双链DNA在大于200bp的范围内序列相同，修复后的序列正确。大肠杆菌和酵母在同源重组修复中起关键作用的是ReoA蛋白。
2.非同源末端连接的重组修复:参加重组的两段双链DNA同源性低,修复后的序列中可存在错误，修复不精确。此方式是哺乳动物细胞DNA双链断裂的一种修复方式，起关键作用的是DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)和XRCC4。
十、简述原核生物的转录终止方式。
①依赖p因子的转录终止:p因子是一种蛋白质。当核心酶移动到终止子时，p因子与其结合并发挥解旋酶活性，解开DNA-RNA杂合双链,使新合成的RNA从模板链上脱落下来，转录终止。
②非依赖p因子的转录终止:核心酶沿模板移动到DNA的终止子序列时，按照该序列转录合成的RNA有两个特征:富含GC碱基对的发夹结构和一串U序列。
发夹结构可影响RNA与模板链的结合，并阻止核心酶前进;U序列则进一步降低RNA与模板链的结合力,从而使转录合成的RNA与模板链分离。随后核心酶与双链DNA解离,转录终止。
分子生物学 分子生物学（molecular biology ）从分子水平研究作为生命活动主要物质基础的生物大分子结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学。重点研究下述领域：（1]蛋白质（包括酶）的结构和功能。（2）[核酸的结构和功能，包括遗传信息的传递。（3）生物膜的结构和功能。（4）生物调控的分子基础。（5）生物进化]。分子生物学是第二次世界大战后，由生物化学,`遗传学,微生物学,病毒学,结构分析及高分子化学等不同研究领域结合而形成的一门交叉科学。目前分子生物学已发展成生命科学中的带头学科。 随着]DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由 RNA转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。 如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 生物学的研究可以说长期以来都是科研的重点，惟其所涉及的方方面面与人类生活紧密相连。本世纪50年代以前的生物学研究，虽然有些已进入了微观领域，但总的来说，主要是研究生物个体组织、器官、细胞或是亚细胞这些东西之间的相互关系。50年代中期，随着沃森和克里克揭示出DNA分子的空间结构，生物学才真正开始了其揭开分子水平生命秘密的研究历程。到70年代，重组DNA技术的发展又给人们提供了研究DNA的强有力的手段，于是分子生物学就逐渐形成了。顾名思义，分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究；分子生物学在理论和实践中的发展也为基因工程的出现和发展打下了良好的基础，因此可以说基因工程就是分子生物学的工程应用。现在基因工程所展现出的强大生命力和巨大的经济发展潜力完全得益于分子生物学的迅猛发展，而且有证据表明，基因工程的进一步发展仍然要依赖于分子生物学研究的发展。 分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学一直是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系和蛋白质-脂质体系。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究，从而出现了分子生物学的蓬勃发展。 分子生物学的发展简史 结构分析和遗传物质的研究在分子生物学的发展中作出了重要的贡献。结构分析的中心内容是通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞的生理功能。 1912年英国布喇格父子建立了 X射线晶体学，成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。以后布喇格的学生阿斯特伯里和贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析。他们的工作为后来生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。 20世纪50年代是分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展的年代。首先在蛋白质结构分析方面，1951年提出了α-螺旋结构，描述了蛋白质分子中肽链的一种构象。1955年桑格完成了胰岛素的氨基酸序列的测定。接着肯德鲁和佩鲁茨在 X射线分析中应用重原子同晶置换技术和计算机技术，分别于1957和1959年阐明了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的立体结构。1965年中国科学家合成了有生物活性的胰岛素，首先实现了蛋白质的人工合成。 另一方面，德尔布吕克小组从1936年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜。噬菌体感染寄主后半小时内就复制出几百个同样的子代噬菌体颗粒，因此是研究生物体自我复制的理想材料。 1940年比德尔和塔特姆提出了“一个基因，一个酶”的假设，即基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。但在当时基因的本质并不清楚。1944年埃弗里等研究细菌中的转化现象，证明了DNA是遗传物质。 1953年沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构，开创了分子生物学的新纪元。并在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。 遗传密码的阐明则揭示了生物体内遗传信息的贮存方式。1961年雅各布和莫诺提出了操纵子的概念，解释了原核基因表达的调控。到20世纪60年代中期，关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚，基因的奥秘也随之开始解开了。 仅仅三十年左右的时间，分子生物学经历了从大胆的科学假说，到经过大量的实验研究，从而建立了本学科的理论基础。进入70年代，由于重组DNA研究的突破，基因工程已经在实际应用中开花结果，根据人的意愿改造蛋白质结构的蛋白质工程也已经成为现实。 分子生物学的基本内容 蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。 蛋白质分子结构的组织形式可分为四个主要的层次。一级结构，也叫化学结构，是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构，称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。有些蛋白质分子是由相同的或不同的亚单位组装成的，亚单位间的相互关系叫四级结构。 蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系，这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。 随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。 发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。 生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由DNA构成。简单的病毒如噬菌体的基因组是由46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA。由于是双股DNA，所以通常以碱基对计算其长度。 遗传信息要在子代的生命活动中表现出来，需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代DNA为模板合成子代DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列；后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列，就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用，故称信使核糖核酸。 基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时，双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开，然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板，复制出于代DNA链。转录是在RNA聚合酶的催化下完成的。 生物体内普遍存在的膜结构，统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看，生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类，以糖蛋白或糖脂形式存在。 生物体的能量转换主要在膜上进行。生物体取得能量的方式，或是像植物那样利用太阳能在叶绿体膜上进行光合磷酸化反应；或是像动物那样利用食物在线粒体膜上进行氧化磷酸化反应。这二者能量来源虽不同，但基本过程非常相似，最后都合成腺苷三磷酸。 生物体利用食物氧化所释放能量的效率可达70%左右，而从煤或石油的燃烧获取能量的效率通常为20～40％，所以生物力能学的研究很受重视。对生物膜能量转换的深入了解和模拟，将会对人类更有效地利用能量作出贡献。 生物膜的另一重要功能是细胞或细胞膜内外的信息传递。在细胞表面，广泛地存在着一类称为受体的蛋白质。激素和药物的作用都需通过与受体分子的特异性结合而实现。癌变细胞表面受体物质的分布有明显变化。细胞膜的表面性质还对细胞分裂繁殖有重要的调节作用。 对细胞表面性质的研究带动了糖类的研究。糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等生物大分子结构与功能的研究越来越受到重视。从发展趋势看，寡糖与蛋白质或脂质形成的体系将成为分子生物学研究的一个新的重要的领域。 分子生物学的成就说明：生命活动的根本规律在形形色色的生物体中都是统一的。例如，不论在何种生物体中，都由同样的氨基酸和核苷酸分别组成其蛋白质和核酸。遗传物质，除某些病毒外，都是 DNA，并且在所有的细胞中都以同样的生化机制进行复制。 物理学的成就证明，一切物质的原子都由为数不多的基本粒子根据相同的规律所组成，说明了物质世界结构上的高度一致，揭示了物质世界的本质，从而带动了整个物理学科的发展。分子生物学则在分子水平上揭示了生命世界的基本结构和生命活动的根本规律的高度一致，揭示了生命现象的本质。和过去基本粒子的研究带动物理学的发展一样，分子生物学的概念和观点也已经渗入到基础和应用生物学的每一个分支领域，带动了整个生物学的发展，使之提高到一个崭新的水平。 过去生物进化的研究，主要依靠对不同种属间形态和解剖方面的比较来决定亲缘关系。随着蛋白质和核酸结构测定方法的进展，比较不同种属的蛋白质或核酸的化学结构，即可根据差异的程度，来断定它们的亲缘关系。由此得出的系统进化树，与用经典方法得到的是基本符合的。 采用分子生物学的方法研究分类与进化有特别的优越性。首先，构成生物体的基本生物大分子的结构反映了生命活动中更为本质的方面。其次，根据结构上的差异程度可以对亲绕关系给出一个定量的，因而也是更准确的概念。第三，对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用这种方法才能得到可靠结果。 分子生物学在生物工程技术中也起了巨大的作用，1973年重组DNA技术的成功，为基因工程的发展铺平了道路。80年代以来，已经采用基因工程技术，把高等动物的一些基因引入单细胞生物，用发酵方法生产干扰素、多种多肚激素和疫苗等，基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。 从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。